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吸光度法测定酶的催化活性

基本的考虑因素。由于吸光度法技术上简单可靠,所用仪器价格合理,因此是目前酶活 测定中首选的方法之一。 当底物或产物是有颜色的,或者是在紫外区有光吸收的,吸光度法就可以非常快速和方 便地进行,因为吸光产物的出现速率或者消失速率可以用分光光度法来跟踪检测。 催化活性z 对应于每分钟的吸光度的变化为: z=(△AV³100)/ε d△t 式中,V 是测量体积,L;t 是时间,min;z 的单位是mol/min,对英语前面章节里给出的国 际单位制U 的定义。

吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法。吸光光度法是采用分光器获得纯度较高的单色光,基于物质对单色光的选择性吸收测定物质组分的分析方法。

吸光光度法的方法原理
吸光光度法是借助分光光度计测定溶液的吸光度,根据朗伯一比耳定律确定物质溶液的浓度。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况。

吸光光度法的特点
A灵敏度高
一般吸光光度法所测定的下限可达10-5~10-6mol/L,因而有较高的灵敏度,适用于微量组分的分析。
B准确度较高
吸光光度法的相对误差为2%~5%,采用精密的分光光度计测量,相对误差为1%~2%,其准确度虽不如滴定分析法高,但已满足微量组分测定的准确度要求,而对微量组分的测定,滴定分析法是难以进行的。
C简便、快速
吸光光度法所使用的仪器——分光光度计,操作简单,易于掌握。近年来,由于一些灵敏度高、选择性好的显色剂和各种掩饰不断出现,常可不经分离直接进行吸光度分析,有效地简化了测量步骤,提高了分析速度。
D应用广泛
几乎所有的无机物和许多有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。从外,该法还可用来研究化学反应的机理,以及溶液的化学平衡等理论。如测定配合物的组成,弱酸、弱碱的理解常数等。由于有机试剂和配位化学的迅速发展及分光光度计性能的提高。吸光光度法已广泛用于生产和科研部门。

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吸光度测定方法
1、单一组分的测定
①比较法。比较法是先配制与被测试液浓度相近的标准溶液c(S)、被测试液c(X),在相同条件下显色、定容后,测其相应的吸光度为A和A(X),根据朗伯一比耳定律:
A(S)=ε(S)b(S)c(S) A(X)=ε(X)b(X)c(X)
由于同一物质,用同一波长及相同厚度的吸收皿测定
ε(X)=ε(S) b(X)=b(S)
所以 A(S):A(X)=c(S):c(X)
即可求出待测试液的含量c(X)。

应当注意,进行计算时,只有当与相近时,结果才可靠,否则将有较大误差
吸光光度法的特点是:因入射光是纯度较高的单色光,故使偏离朗伯一比耳定律的情况大为减少,标准曲线直线部分的范围更大,分析结果的准确度较高。因可任意选取某种波长的单色光,故利用吸光度的加和性,可同时测定溶液中两种或两种以上的组分。由于入射光的波长范围扩大了,许多无色物质,只要它们在紫外或红外光区域内有吸收峰,都可以用吸光光度法进行测定。
②标准曲线法
2、高含量组分的测定——示差法
3、多组分的分析

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