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荧光光度法测定酶的催化活性

荧光光度法测定酶的催化活性,此方法很少用于粗酶或者是纯酶制备中催化活性的检测。由于它具有很高的灵敏度,可以用于器官或者组织区域的微量酶的测定。 总体上,这种方法的灵敏度是吸光光度法的1000 多倍。主要用于对经光源激发后产生荧光的物质或经化学处理后产生荧光的物质成份分析,可应用于生物化学、生物医学、环境化工等部门。

荧光光度法和分光光度法有什么不同?

实际上分光光度计的概念较多,分光光度计还有紫外分光光度计,红外分光光度计等叫法.其主要是根据能量跃迁原理来区分.
例如 紫外分光光度计 是测量物质经过紫外激发后物质可以吸收紫外光多少,测量的值是通过物质的光,检测信号与发射信号在一条直线上.
荧光分光光度计 是给与一个激发波长后,到达激发态,再发射光,所以检测的是物质发射的光,检测信号与发射器不在一条线上.
例如蛋白质,因为里面有酪氨酸、色氨酸的发色基团,一般的联苯结构,也就是可以形成ππ共轭体系的物质都可发射荧光.如果物质自身不带有荧光,则可以加入荧光探针. 荧光分光光度计

荧光分光光度计 是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm,发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品(如凝胶条)的光谱扫描。

荧光分光光度计的种类 :可分为单光束式荧光分光光度计和双光束式荧光分光光度计两大系列。

荧光分光光度计的发展经历了手控式荧光分光光度计,自动记录式荧光分光光度计,计算机控制式荧光分光光度计三个阶段;其他的还有低温激光Sh p ol’skill荧光分光光度计,配有寿命和相分辩测定的荧光分光光度计等。

荧光分光光度计的构成

1. 光源:
为高压汞蒸气灯或氙弧灯,后者能发射出强度较大的连续光谱,且在300nm~400nm 范围内强度几乎相等,故较常用。
2.激发单色器:
置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器,筛选出特定的激发光谱。
3.发射单色器:
置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器,常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。
4. 样品室:
通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时,光源与检测器成直角安排;测量固体时,光源与检测器成锐角安排。
5. 检测器:
一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。

荧光分光光度计的基本原理

由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出荧光,荧光经过滤过和反射后,被光电倍增管所接受,然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出,从而产生荧光.
不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征,这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱;,因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中,当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似,荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

荧光分光光度计的功能特点

1. 荧光发射光谱
选择某一固定波长的光激发样品,记录样品中产生的荧光发射强度与发射波长间的函数关系,即得荧光发射光谱。
2. 荧光激发光谱
选定某一荧光发射波长记录荧光发射强度作为激发光波长的函数,即得荧光激发光谱。
3.时间分辨技术;
可用于对混合物中光谱重叠但有寿命差异的组分进行分辨并分别测量。
时间分辨荧光测定公式如下:
P(t) = P0 EXP (-t /τ)
式中P(t):拟合指数函数
P0:强度取值
EXP:指数运算符
t:时间取值
τ:荧光平均时间寿命

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