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发光法测定酶的催化活性

发光法测定酶的催化活性,发光法应用荧光、磷光以及化学发光等作为检测器体系。活的生物体中观察的化学放 光称作生物体发光。生物体发光是由成为荧光素酶的酶类催化产生的,这类酶的底物即虫荧 光素,被转化为发光产物。

在发光法中,单位时间内反应体系发射的光子数目可以由特殊设 计的仪器——照度计来测量,这类仪器是以单光子探测器为基础的,通常是光电倍增管。 由来源于萤火虫的荧光素酶催化的反应就是一个例子,萤火虫荧光素4-单加氧酶(ATP 水解酶) ATP+D-虫荧光素+O2→氧合虫荧光素+AMP+pp+CO2+0.9hν 在该反应中,ATP 作为底物被消耗掉,光子在 562nm 的波长处发射。每摩尔的虫荧光 素的量子产量是0.9 爱因斯坦,也即消耗掉一分子ATP,大约发射1 个光子。因此该反应适 合用来测定ATP,从而测定那些能够催化ATP 消耗或者是ATP 生产的反应的那些酶。 为借助于萤火虫的生物发光来检测酶的活性,光强度必须在几分钟内呈线性增加,而且 必须严格正比于酶的催化活性。这些测定条件在测定肌酸激酶的催化活性时,已经得到了实 现。 磷酸肌酸+ADP→肌氨酸+ATP 其他依赖于NAD(P)的反应可以通过来源于发光细菌的生物发光来跟踪检测。

过氧化物酶(POD)活性的测定 —愈创木酚法

一、实验原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反 应,产物为醌类化合物。 实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。 在此酶存在下,H2O2 将愈创木酚氧化生成 茶褐色产物。此产物在470nm 有最大光吸 收,故可通过470nm处的吸光度变化测定过 氧化物酶的活性。

二、材料和设备

1、材料 :马铃薯块茎 2、仪器设备:751 型分光光度计、离心机、研 钵、25ml 容量瓶、量筒、试管、吸量管。 3、试剂:0.05ml/L愈创木酚溶液, 0.05ml/L的磷酸缓冲液(pH5.5), 2%H2O2, 0.1mol/L儿茶酚溶液, 20%三氯乙酸溶液

三、实验步骤

1、酶液的制备 取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎,切碎,放 入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀 浆。将匀浆液全部转入离心管中,于3000g 水中离心10min,上清液转入25ml 容量瓶 中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次,上 清液并入容量瓶中,定容至刻度,低温下 保存备用。 2、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml 2%H2O2、 1.0ml 0.05mol/L 愈创木酚和0.1ml酶液。 以在沸水中加热5min的酶液为对 照,做二组重复实验。反应体系加入酶液 后,立即于37℃水浴中保温15min,然后迅 速转入冰浴中,并加入2.0ml 20%三氯乙 酸终止反应。然后,过滤(或5000g 离心 10min),滤液适当稀释,用751型分光光度 计在470nm波长下测定反应体系的吸光度。

四、实验结果

以每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活力单位 酶活力=——× D △A 0.01t 酶的比活力=——× D △A 0.01Wt 式中, △A为反应时间内吸光度的变化;W为马铃 薯鲜重(g);t为反应时间(min);D为稀释倍数, 即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数 CAT过氧化氢酶活性测定方法 过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名 触酶(Catalase,CAT),是一类以铁卟琳为 辅基的结合酶,由4个亚基组成,分子量为 240 000。存在于动植物组织与细胞中的氧 化还原酶类,它专一性地将细胞代谢产生 的过氧化氢分解成H2O和02,避免了H202在体 内积累,从而可维持体内正常的活性氧水 平。是最早发现的与种子活力有关的氧化 酶类之一.

过氧化氢酶的应用: 被用于食品包装,防止食物被氧化。 在纺织工业中,被用于除去纺织物上的过氧化氢,以保证成品是不含 过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上:眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡 后,使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。

近年来,过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该 酶和过氧化氢,目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸(利用氧气并生成二氧化碳) 和共生性氮固定(将氮气(N2)解离为活性氮原子)。细胞被病原体 感染时,过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性,是一项衡量谷物品质的 重要指标。

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因 酶制剂产品众多,如:过氧化氢酶 粉末、α-葡萄糖苷酶、胆固醇酯酶 、尿酸酶、辅酶A、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶、乙酰胆碱酯酶、弹性蛋白酶、胆固醇氧化酶 、超氧化物歧化酶、肠激酶、胆红素氧化酶、嘌呤核苷磷酸化酶、葡萄糖氧化酶、凝血酶、心肌黄酶、磷酸葡萄糖变位酶、己糖激酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、黄嘌呤氧化酶、溶菌酶等,详情进入酶制剂产品页

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