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超氧化物歧化酶的活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)的活性测定 黄嘌呤氧化酶法

原 理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生 超氧阴离子自由基(O2-),后者氧化羟胺形成亚 硝酸盐,在显色剂的作用下呈紫红色,用可见光 分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时, 则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用,使 形成的亚硝酸盐减少,比色时测定管的吸光度值 低于对照管的吸光度值,通过公式计算可求出被 测样品中的SOD活力。 实验试剂: 硫酸盐缓冲液,盐酸羟胺,黄嘌呤,黄嘌 呤氧化酶,醋酸等。

实 验步骤: 计算方法: 每毫升反应液中SOD 抑止率达50%时对应 的SOD 量为一个SOD 活力单位(U),待测 样品中的SOD 活力由下式计算: SOD抑制率(%)=(A2-A1)/A2×100% SOD 活力(U/ml)=(A2-A1) /A2×100%÷50%×反应体系的稀释倍数× 样本测试前的稀释倍数 式中:A1:测定管的吸光值;A2:空白管的 吸光值。

邻苯三酚 自氧化法  原理: 在碱性条件下, 邻苯三酚迅速氧 化释放出超氧化物阴离子,生成有色中间 产物,吸光度随之增加,使吸光度值与反 应时间呈良好的线性关系。 SOD 加入邻苯 三酚自氧化反应体系后,催化超氧化物阴 离子生成过氧化氢,使有色中间产物的生 成受阻,导致吸光值下降,邻苯三酚自氧 化速率降低,可作为测定 SOD 活性的理论 依据。

1.试剂: 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液 (pH8.2 2mmol/L EDTA) 0.2mol/L (Tris)三羟甲基氨基甲烷(内含 4mmol/L 乙二胺四乙酸EDTA )100ml 与 0.2mol/L HCl44.76ml 混合加双蒸水至 200ml pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)以 10mmol/LHCl 配制成 6mmol/L溶液存放于冰 箱备用。

2.仪器: 紫外分光光度计,酸度计,恒温 水浴锅

实 验步骤: (1).邻苯三酚自氧化速率测定: 在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris缓冲溶液,于 25℃保温20min,加入10~20ul 30mmol/L邻苯三 酚,立即计时并摇匀,倾于比色杯内,于325nm 下,每隔1min测吸光值一次,空白以10mmol/L HCl代替邻苯三酚,要求自氧化速率控制在0.070 OD/min左右。 ? . SOD活性测定: 将样液加入到Tris缓冲溶液中,其余步骤同自 氧化速率测定方法。 活力单位定义:将一定条 件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量 定义为一个单位(u)。

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