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抗坏血酸过氧化物酶活性测定

在茶叶中 实验原理 APX(抗坏血酸过氧化物酶)催化AsA与H2O2 反应而使H2O2:2AsA+ H2O2→2MD-AsA( 单脱氢抗 坏血酸)+2H2O。

抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血 酸为电子供体的,APX首先与H2O2形成中间复合 物,中间复合物接着氧化AsA形成产物,当AsA未 被复合物利用时,APX失活。只要AsA能够再生, APX就能充分进行催化反应,从而保护叶绿体维持 正常的光合能力。 APX酶液的制备 称取0.5g的茶树鲜叶剪碎,加入适量 的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液,在冰浴 中充分研磨,离心(10000g、4℃、20min) 取上层清夜1mL,分装于小离心管中置于 4℃备用或-20℃保存。

APX活性的测定

提取液:50mmol/LPBS(磷酸氢二钾-磷酸二 氢钾缓冲液),pH7.8;2mmol/L AsA; 5mmol/L EDTA。 反应液:50mmol/LPBS,pH7.0;0.5mmol/L AsA;0.1 mmol/L EDTA。 在三个比色皿中各加入20? L鲜叶APX粗酶液, 再加入3mL反应液;1号比色皿中不加AsA和 H2O2启动反应;每10s连续记录室温下290nm 吸光值的变化X。室温下每一分钟氧化 1? molAsA的酶量作为一个酶活性单位(U)。

计算公式

每克鲜叶APX的酶活性U= (X×7.5×1000×60×1000)/ (m×2.8×20×10) 上式中,X:OD值的变化;7.5:每克材料 提取7.5mL粗酶液;1000:将ml转化成?L; 60:将1min转化成60s;1000:将mmol转化 成?mol;m:鲜叶的重量,单位为g;2.8: 吸光系数mmol/L cm;20:用20?L酶液进行 活性测定;10:每10s记录吸光值的变化。 测定茶树鲜叶APX活性的最佳条件 PVPP的加入量为鲜叶重的1.5倍,提取液 pH为7.8,反应液pH为7.0,底物AsA浓度为 0.5mmol/L。

注意事项:

(1)由于测定反应是通过测定反应底物AsA的降 低来计算APX活性,因此所加的酶量一般不宜过大 ,应使加液量控制在60s内,使产生的A290光值下 降呈良好的线性关系。

(2)由于此反应中AsA和H2O2量都很少,可以将 30%的H2O2稀释500倍,在测定时直接吸取15?L的 H2O2与3mL反应液将加入到比色皿中,启动反应。

(3)H2O2由于本身对AsA的氧化作用在测定时间 内可以忽略不计。

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