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DMP法测定漆酶酶活

DMP法测定漆酶酶活

A.1 原理

漆酶能氧化DMP为3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌,该产物在470nm处有最大吸收峰,其消光系数为49.6 mmol -1 Lcm -1 ,在一定浓度范围内该产物浓度与其吸光度值成线性关系,通过测定吸光度的变化值来计算产物的生成速率,酶活的定义为在一定条件下,每分钟氧化1 umol DMP或生成1umol 3,5,3’,5’-四甲氧基二苯基醌所需要的酶量定义为1个酶活单位。

A.2.1 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.5)

称取柠檬酸14.71g,用水准确稀释至700ml,称取磷酸氢二钠14.33g,用水溶解并准确稀释至200 mL。将柠檬酸溶液加入到磷酸氢二钠溶液中,边加边搅拌并调pH至3.5。

A.2 .2 DMP

称取DMP0.154g,用水溶解并定容至100mL。

A.3 仪器和设备

可见分光光度计

分析天平:精度为±0.0001g。

pH计:精度为±0.01 pH单位。

恒温水浴:精度±0.2℃

A.4 步骤

漆酶酶活测定以DMP为底物,每3ml反应体系含:2.4ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.5),0.5ml DMP,60 ℃保温5 min,加入0.1ml(稀释适当倍数的)酶液,同时按下秒表计时,在470 nm处用可见分光光度计在0s时记录一次吸光度值,记为X 0 ,间隔60s再记录一次吸光值,记为X 60

固体酶制剂测酶活预处理:称取0.1g固体粉末,加1ml去离子水溶解,待充分溶解后8000rpm离心5min,取上清按上述方法测其酶活。测得酶活单位为U/ml,换算成固体酶制剂的酶活还需乘以系数10,酶活单位为U/g。

A.5 计算结果

E= ×n×7.258     …………………………………(A.1)

式中:

E:酶活力,U/ml

X 60 :60s时记录的吸光度值

X 0 :0s时记录的吸光度值

n:稀释倍数

A.6 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不应超过平均值的3%。

此方法仅作为参考,具体环境不同,相应的也会有所不同!

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